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簡化基因組甲基化測序(RRBS)

項目介紹

簡化基因組甲基化測序 (Reduced Representation Bisulfite Sequencing, RRBS) 是通過限制性酶切的方法
富集基因組DNA上富含CCGG位點的片段,經Bisulfite處理和高通量測序技術
進行基因組CpG富集區域內的單堿基分辨率的甲基化測序。
相對WGBS而言RRBS技術作為高性價比的甲基化測序方案,
測序量大幅減少,在大規模臨床樣本研究中具有很不錯的應用價值。


技術優勢

高性價比DNA甲基化測序方案

具有Bisulfite測序單堿基分辨率

富集CpG島和啟動子區域,測序目標性強

適合動物物種,哺乳動物可以檢測高達0.5M以上CpG位點

多樣本的覆蓋區域重復性可達80%以上


科學方案設計

從項目背景了解、協助方案設計、實驗材料選取、建庫測序,到數據分析,

每個項目有特定的科學問題;需要專業、有價值的建議;科學、縝密的設計;

及時高效的溝通;以保障高質量研究成果。

信息分析

基于簡化基因組范圍的甲基化分析,數據質控、5mC Calling, 

5mC在基因組、染色體、功能元件上的分布

多樣本甲基化差異聚類、差異甲基化DMR鑒定及相關基因的功能分析,

結合項目背景和科學問題的數據亮點挖掘。

分析內容

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用心服務每一個項目

最早開發簡化基因組甲基化測序技術方法的團隊之一

已完成人、小鼠、大鼠、豬等多種哺乳動物簡化基因組甲基化測序分析

助力客戶在EpigeneticsEpigenomicsBMC genomicsBMC Genetics等雜志發表多篇論文

專業的技術支持,嚴格的實驗把關,豐富的項目經驗,高效的溝通機制,用心服務好每一個項目




簡化基因組甲基化測序(RRBS)案例展示

案例分析一 (團隊成員發表)

微生物的定植對腸道早期免疫和代謝相關基因DNA甲基化的影響

Early microbial colonization affects DNA methylation of genes related to intestinal immunity and metabolism in preterm pigs. DNA Res. 2018 Jan 19.(IF=5.415)

一、研究背景

表觀遺傳學調控可能在介導微生物-宿主相互作用,以及出生后腸道基因表達對細菌定植的適應性中發揮著重要作用,在早產兒的腸道中表現可能更為突出,因為未成熟的小腸對細菌的入侵尤為敏感。在本研究中,我們以早產幼豬為模型,比較了正常(CON) 和口服抗生素處理過的(AB)早產豬的腸道DNA甲基化和微生物菌群的差別,以探究腸道早期微生物的定植如何通過表觀機制對早產兒的短期和長期的腸道健康的重要作用。

二、方法流程

1、取材:三頭母豬產的14頭早產豬的全腸組織

對照組:CON group, n=7

抗生素處理組:AB group, n=7

2、測序:簡化基因組甲基化測序(RRBS)

         微生物16S測序

3、驗證:高通量BSP:差異甲基化基因

RTq-PCR: 基因表達差異

4、功能:

三、研究結果

1) 抗生素處理減少了腸道細菌密度以及多樣性(~100),但提高了對壞死性腸結腸炎(NEC)的抵抗力;

2) 抗生素處理改變了腸道組織DNA甲基化修飾的水平;

3) 與先天免疫應答、吞噬、內皮穩態和組織代謝等相關基因(CPN1C3LBPHIF1AMicroRNA-126PTPRE)DNA甲基化和表達存在顯著的差異,而且這種差異早在NEC病變之前就已形成。

四、研究結論

新生的未成熟小腸DNA甲基化的改變受到了腸內細菌定植的影響,這種有賴腸道菌群的表觀遺傳修飾參與調控腸道免疫、血管完整性和營養代謝,可能對早產兒的短期和長期的腸道健康至關重要。

  

 
     圖1. 菌群在腸道內的定植對DNA甲基化的影響                         圖2. 甲基化組和蛋白組網路分析                                         圖3. 缺氧與血管功能相關基因的表達  

 



 

案例分析二(團隊成員發表)

Ph+慢粒白血病甲基化研究

Next-generation sequencing identifies major DNA methylation changes during progression of Ph+ chronic myeloid leukemia. Leukemia. 2016;30(9):1861-8. (IF=11.702)

一、研究背景

DNA甲基化對Ph+慢粒白血病(CML)發生、發展的影響尚不清楚。本文通過簡化基因組甲基化測序(RRBS)的方法研究慢性期(CP-CML)、加速期(AP-CML)和急變期(BC-CML)CML患者和對照組CML的甲基化變化,以探索CML發病機制及為揭示晚期CML治療的新靶點提供新的策略。

二、方法流程

1、取材:31CML樣本及5個對照樣本的單核細胞

    CP-CML(n=17), AP-CML(n=5), BC-CML(n=9),

對照組Ctrl group (n=5)

2、測序:簡化基因組甲基化測序(RRBS)

         轉錄組測序(RNA-Seq)

3、驗證:MS-HRM:驗證差異甲基化基因

qRT-PCR: 驗證基因表達差異

4、功能:

三、研究結果

1) 與正常對照組相比,CP-CML患者僅檢測到~600個差異甲基化的CpG位點,而BC-CML患者則檢測到~6500個差異甲基化的CpG位點;

2) 在大多數受影響的CpG位點, 甲基化水平增加;

3) 在進展到AP-CML/BC-CMLCP-CML患者中, 鑒定了897個在進展期而不是在診斷時甲基化的基因;

4) 通過RNA測序和比較CP-CML樣品,觀察到BC-CML中許多甲基化基因的表達下調,其中一些是眾所周知的腫瘤抑制基因或細胞增殖調控基因,并且通過表觀藥物(甲基化酶抑制劑)處理,觀察到這些甲基化抑制基因重新表達。

四、研究結論

總之,研究結果顯示CpG位點甲基化在慢性粒細胞白血病進展過程中明顯增加,并可能為揭示晚期CML治療的新靶點提供有用的基礎。


      


               圖1. 基于RRBS檢測的CML 樣本甲基化CpG統計                                                        2. 甲基化聚類及差異甲基化位點
 




                       
                        
圖3. AP-CML和BC-CML中甲基化基因熱圖                                                                                     圖4. 甲基化抑制表達的基因


簡化基因組甲基化測序(RRBS)結果展示

外顯子組測序

簡化基因組甲基化測序(RRBS)常見問題

Q1:為什么RRBS主要應用于哺乳動物?

RRBSMspI酶切將CpG位點富集出來進行測序,該酶的酶切位點為CCGG,因此RRBS只能檢測發生于CCGG /GGCC位點的胞嘧啶甲基化修飾現象。哺乳動物中DNA甲基化主要發生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上,而植物基因組甲基化位點廣泛分布在CpG和非CpG位點(CHH,CHG),因此,RRBS主要運用于人、小鼠和DNA甲基化主要發生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上的哺乳動物,其它動物物種想做RRBS,最好先進行評估該物種基因組上CCGG位點特征。

Q2RRBS測序覆蓋區域如何?

RRBS一般可以覆蓋80%以上的CpG島和Promoter(這注意:這個比例僅僅是針對數目,RRBS覆蓋某個Promoter區域的5CG位點,即算覆蓋該Promoter);而且與測序深度、測序質量等有關;

Q3:那些因素會影響大樣本RRBS測序結果?

RRBS一般適合人、鼠等哺乳動物大樣本甲基化研究,在做類似Case Vs. Control對比研究課題中,多樣本測序覆蓋區域的重疊比例很重要,這與樣本DNA質量(要求DNA完整性好,而片段化的FFPE樣本會差很多)、實驗流程及測序深度、測序質量等都有關。


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